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    技术文章 Article

    CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项

    点击次数:1824 发布时间:2016-02-22

    一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理

    Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。


    用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验
     

    CCK8的优点

    • 使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素和有机溶剂;
    • CCK-8法能快速检测;
    • CCK-8法的检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度;
    • CCK-8法的重复性优于MTT 法;
    • CCK-8法对细胞毒性小;
    • CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。


    CCK8的缺点

    • 与MTT法相 比,CCK8和XTT的价格比较贵。
    • CCK8试剂的颜色为淡红色,与含酚红的培养基颜色接近,不注意的话容易产生漏加或多加。


    与以往的增殖/毒性测定试剂相比较
     

    检测方法

    MTT法

    XTT法

    WST-1法

    CCK8法

    甲臢产物的水溶性

    差(需加有机溶剂溶解)

    产品性状

    粉末

    2瓶溶液

    溶液

    1瓶溶液

    使用方法

    配成溶液后使用

    现配现用

    即开即用

    即开即用

    检测灵敏度

    很高

    很高

    检测时间

    较长

    较短

    较短

    zui短

    检测波长

    560-600nm

    420-480nm

    420-480nm

    430-490nm

    细胞毒性

    高,细胞形态完全消失

    很低,细胞形态不变

    很低,细胞形态不变

    很低,细胞形态不变

    试剂稳定性

    一般

    较差

    一般

    很好

    批量样品检测

    可以

    非常适合

    非常适合

    非常适合

    便捷程度

    一般

    便捷

    便捷

    非常便捷


    二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法
    实验一:细胞增殖分析

    1、制备细胞悬液:细胞计数

    2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。

    3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。
    4、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基,以换液的形式加入。
    5、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认zui佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。

    6、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。
     

    实验二:细胞毒性分析
    1、制备细胞悬液:细胞计数

    2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。

    3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。

    4、加入不同浓度的毒性物质

    5、37℃培养箱中培养:加入毒性物质的培养时间,要看毒性物质的性质和细胞的敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要一代以上的时间。
    6、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
    7、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认zui佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。

    8、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。


    注:

    • 若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
    • 如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸取即可。

     

     

    三、CCK8检测细胞增殖/毒性的注意事项

     

    • 当使用标准96孔板时,贴壁细胞的zui小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。
    • 酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
    • CCK8可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染,以免影响结果。
    • CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月,在-20℃下避光可以保存1年。
    • 当在培养箱内培养时,培养板zui外一圈的孔zui容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。一般情况下,zui外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。
    • 在培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时,还应考虑药物的吸取,可在加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。
    • 金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话,将会100%抑制。
    • 悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

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